DeutschesFachbuch.de : Analytische Biochemie Eine praktische Einführung in das Messen mit Biomolekülen

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Inhalt
VorwortV
Verzeichnis der verwendeten AbkürzungenXV
Part I Grundprinzipien der Analytik mit biochemischen Reagenzien 1
1 Biomolekulare Erkennung 3
1.1 Biomolekulare Erkennung und Bioanalytik 3
1.2 Anwendungsgebiete der Bioanalytik 5
1.2.1 Klinische Diagnostik 6
1.2.2 Wirkstoffscreening 8
1.2.3 Lebensmittelanalytik 8
1.2.4 Prozesskontrolle in der Biotechnologie 10
1.2.5 Umweltanalytik 12
2 Methoden der Analytik mit Enzymen 15
2.1 Grundlagen 15
2.1.1 Nomenklatur und Klassifizierung der Enzyme 15
2.1.2 Die Natur der Enzyme 18
2.1.2.1 Struktur und Zusammensetzung 18
2.1.2.2 Apoenzym und Cofaktoren 20
2.1.2.3 Spezifität 20
2.1.2.4 Enzymaktivität, pH- und Temperaturoptimum 22
2.1.2.5 Die Enzymkatalyse 22
2.1.2.6 Kinetische Aspekte - Einfluss der Substratkonzentration 24
2.1.3 Substratbestimmungen 27
2.1.4 Enzymaktivität und Enzymkonzentration 27
2.1.4.1 Enzymeinheiten 27
2.1.4.2 Bestimmung der Enzymaktivität 28
2.1.5 Effektoren 29
2.1.5.1 Hemmung von Enzymreaktionen 29
2.1.6 Isoenzyme und allosterische Enzyme 30
2.1.7 Nichtproteinenzyme 31
2.2 Nachweisreaktionen 32
2.2.1 Messtechniken 32
2.2.2 Die häufigsten Indikatoren 34
2.2.3 Verfahren der enzymatischen Substratbestimmung 36
2.2.3.1 Endpunktmethode 36
2.2.3.2 Kinetische Methode 37
2.2.4 Gekoppelte Tests 38
2.2.5 Messung von Aktivatoren und Inhibitoren 40
2.2.6 Häufig verwendete Enzyme 42
3 Antikörper in der Analytischen Biochemie 43
3.1 Immunochemische Grundlagen 43
3.1.1 Antikörper 43
3.1.1.1 Struktur der Antikörper 44
3.1.2 Antigene und Haptene 46
3.1.3 Die Antigen-Antikörper-Reaktion 47
3.2 Immunochemische Bestimmungsmethoden 49
3.2.1 Immunoassays 49
3.2.1.1 Einleitung 49
3.2.1.2 Heterogene Enzymimmunoassays (EIA)52
3.2.1.3 Homogene Enzymimmunoassays 56
3.2.2 Immunosensoren 57
4 Nukleinsäuren 59
4.1 Die Natur der Nukleinsäuren 59
4.2 Analytik von Nukleinsäuren 59
4.2.1 Aufarbeitung von Nukleinsäuren 62
4.2.2 Quantifizierung 62
4.2.2.1 Quantifizierung durch Absorptionsmessung 62
4.2.2.2 Quantifizierung mit Fluorochromen 63
4.2.3 Gelelektrophorese 64
4.2.4 Sequenzierung 65
4.3 Molekulare Grundlage der Nukleinsäureerkennung 68
4.4 Die Polymerase-Kettenreaktion 70
4.4.1 Das Prinzip 70
4.4.2 Der Nachweis 72
4.5 Nukleinsäure-Chips 73
4.5.1 Herstellung von Mikroarrays und Biochips 74
4.5.1.1 Synthese auf dem Chip 75
4.5.1.2 Spotten vorsynthetisierter Bindemoleküle 76
4.5.2 Hybridisierung 83
4.5.3 Detektion 84
5 Immobilisierung der Biokomponenten 87
5.1 Einführung 87
5.2 Physikalische Immobilisierungsverfahren 87
5.2.1 Einschluss wässriger Enzymlösungen in Hohlkörper 88
5.2.2 Einschluss von Enzymen in Polymere 89
5.2.2.1 Geleinschluss in hydrophile Polymere 89
5.2.2.2 Einschluss in hydrophobe Polymere 91
5.2.3 Immobilisierung an Festphasen 92
5.2.3.1 Trägermaterialien 92
5.2.3.2 Adsorption an unlösliche Träger 92
5.2.3.3 Kovalente Bindung 94
6 Analysensysteme mit immobilisierten Biomolekülen 99
6.1 Einführung 99
6.2 Teststreifen 99
6.2.1 Entwicklungsstufen der Trockenchemie 100
6.2.2 Aufbau und Funktion 101
6.2.2.1 Teststreifen für Metabolite 101
6.2.2.2 Partikelabtrennung bei Vollblutmessung 103
6.2.2.3 Immunoteststreifen für Enzymaktivitäten, Hormone, Pharmaka und Markerproteine...
6.3 Biosensoren 105
6.3.1 Grundprinzipien von Biosensoren 105
6.3.2 Gerichteter Ladungstransfer in Enzymelektroden 108
6.3.3 Anwendung von Biosensoren in der medizinischen Diagnostik 109
6.3.3.1 Messplätze und Laboranalysatoren 109
6.3.3.2 Patientenselbstkontrolle 109
6.3.3.3 Online-Messung mit implantierbaren Biosensoren 110
6.4 DNA-Chip-Technologie 110
6.5 Miniaturisierte Analysensysteme 111
6.6 Nanobiotechnologie 113
7 Weiterführende Literatur 115
PartII Experimente zur Analytischen Biochemie 119
P 1 Bestimmung von Glucose und Stärke in Lebensmittelproben mit immobilisierten Enzym...
P 1.1 Aufgabenstellung 121
P 1.2 Grundlagen 121
P 1.2.1 Glucose 122
P 1.2.2 Stärke 122
P 1.2.3 Aufbau und Funktionsweise von Teststreifen 123
P 1.2.4 Funktionsweise von Glucosebiosensoren 124
P 1.2.5 Immobilisierte Enzyme in Enzymreaktoren 125
P 1.3 Durchführung 126
P 1.3.1 Bestimmung von Glucose in Lebensmittelproben mit Glucoseteststreifen und Gluc...
P 1.3.1.1 Teilaufgabe 1: Teststreifen 127
P 1.3.1.2 Teilaufgabe 2: Biosensor 129
P 1.3.1.3 Methodenvergleich 131
P 1.3.2 Teilaufgabe 4: Bestimmung von Stärke mit Glucoamylasereaktor und Glucoseelekt...
P 1.3.2.1 Aufbau der Fließapparatur mit Enzymreaktor und Biosensor 132
P 1.3.2.2 Präparation des Glucoamylasereaktors 132
P 1.3.2.3 Bestimmung von Stärke und Maltose 133
P 1.4 Reagenzien und Geräte 133
P 1.4.1 Geräte 133
P 1.4.2 Reagenzien 133
P 1.5 Literatur 134
P 2 Bestimmung von L-Malat in einer Lebensmittelprobe mit gekoppelten Enzymreaktionen...
P 2.1 Aufgabenstellung 135
P 2.2 Grundlagen 135
P 2.2.1 L-Malat 135
P 2.2.2 Optisches Detektionsprinzip 136
P 2.2.3 Malatbiosensor 137
P 2.3 Durchführung 138
P 2.3.1 Teilaufgabe 1: Photometrische Bestimmung von L-Malat 138
P 2.3.2 Teilaufgabe 2: Bestimmung von L-Malat mit Biosensor 139
P 2.3.2.1 Herstellung der Enzymmembran 139
P 2.3.2.2 Malatmessung 140
P 2.3.3 Methodenvergleich 140
P 2.4 Geräte und Reagenzien 140
P 2.4.1 Geräte 140
P 2.4.2 Reagenzien 141
P 2.5 Literatur 141
P 3 Messung von Peroxidase aus Meerrettich und Bestimmung der kinetischen Konstanten ...
P 3.1 Aufgabenstellung 143
P 3.2 Grundlagen 143
P 3.2.1 Peroxidasen 143
P 3.2.2 Enzymkinetik 144
P 3.3 Durchführung 145
P 3.3.1 Bestimmung des Absorptionsmaximums des Reaktionsproduktes 145
P 3.3.2 Einfluss der Substratkonzentration 146
P 3.3.3 Auswertung 146
P 3.4 Geräte und Reagenzien 147
P 3.4.1 Geräte 147
P 3.4.2 Reagenzien und Lösungen 147
P 3.5 Literatur 147
P 4 Messung von Inhibitoren der Acetylcholinesterase und Charakterisierung der Hemmun...
P 4.1 Aufgabenstellung 149
P 4.2 Grundlagen 149
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Sachverzeichnis
A
Absorptionsmessungen 143
ABTS (2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz) 144, 196
Acetylcholin 149
Acetylcholinesterase 149-156
- Aktivität 154
- Hemmung 149-156
- Messung von Inhibitoren 149-156
Adsorption 92
Affinitätskonstante 47
Affinitätssensoren 107
Agarosegel-Elektropherese 171, 175
- Prinzip 171
- Längenbestimmung 175
Agglutination 49
Ausbluten 91
Aktivierungsenergie 22
Aktivität
- molare 28
- spezifische 28
alkalische Phosphatase 104, 184-185
- Markierungsenzym 185
Alkanthiol 160
allosterisches Enzym 30
Alterung von Lebensmitteln 9
Aminkopplung 208
Annealing 70
Antigen-Antikörper-Reaktion 47-49
Antiinterferenz 40
Antikörper 3, 43-57
- Detektor-Antikörper ("detector antibody") 56
- Fänger-Antikörper ("catching antibody") 56
- monoklonal 43
- polyklonal 43, 195
- Produktion moderner Antikörper (Übersicht) 44
Antikörperbindungskapazität, Bestimmung 210
Antioxidanzien/antioxidative Substanz 9, 155-156
- Messung 159
- Vitamin C 158
Aptamer 5, 107
Arrayer 73, 77, 171, 177
Assoziationskonstante 203
Authentizität 5
Avidität 47
2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz (ABTS) 143, 196
B
"bed-side-analytics" 100
BIA ("Biospecific Interaction Analysis") 207
Biacore 204
- Sensorgramm 205
Bibliotheken, kombinatorische 8
Bindung, unspezifische 56
Bindungskinetik 207
Bindungsvorgang, Kinetik 206
Bioindikator 12
Biochips 74-82
- Herstellung 74
Bioelektronik 113
Biokatalysator 15
biologische Waffen 6
biomimetische Erkennungselemente 5
- Aptamer 5
- Imprint 5
- Peptidnukleinsäure 5
Biosensor (s. auch Sensor) 105-106, 203-213
- Affinitätssensoren 107
- Anwendung in der medizinischen Diagnostik 109-111 - Definition 105
- elektrochemischer 105
- Fließapparatur 132
- gekoppelte Enzyme 135
- Glucosebiosensoren 106, 121-134
- implantierbarer 110
- L-Malat-Biosensor 135-142
- optischer 203-213
"biospecific interaction analysis" (BIA) 207
Biotechnologie, Prozesskontrolle 10-12
Biotest 12
Blutgruppenbestimmung 49
Blutprobe, Aufarbeitung 169, 173
BSE 8
Burk, Enzymkinetik 144
C
cancerogen 63
Carbamat 150
Carbamoylester 150
Carbodiimid 94
chemische
- Kopplung 74
- Modifizierung, Sensor 159
Cholinesterase 13, 149-150
Chronoamperometrie 157, 162
Clark'sche Enzymelektrode 106
Code, genetischer 4
Cofaktor 20
Creatinin (s. Kreatinin) 7
cyclische Voltammetrie 160
Cytochrom c 109, 159
- immobilisiertes 157, 164
- Sensor 164
Cytotoxizitätstest 12
D
Desoxyribonukleinsäure (s. DNA) 59, 62, 110-111
Detektor-Antikörper ("detector antibody") 56
Diabetes 109
Diagnose/Diagnostik
- Fenster, diagnostisches 56
- molekulare 7
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2, 4-D) 49, 155, 183
- kompetitiver Enzymimmunoassay 189-193
Didesoxyribonukleosidtriphosphat 67
Diffusion 27
Dissoziations-Geschwindigkeitskonstante, Bestimmung 212-213
Dissoziationskonstante 49, 203
DNA (Desoxyribonukleinsäure) 59, 62, 110-111
- optische Dichte 63
- Präparationskit 170
- Struktur 60
DNA-Chip-Experiment 69
DNA-Chip-Technologie 110-111
Dot-(Blot)-Immunoassay 53-56
Drähte, molekulare 109
E
EDC (N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid) 208
Effektor 20, 29-30
Einschlussverfahren 87
elektrochemische Technik 33
elektrochemisches Messsystem 163
Elektroden 105-110, 124
- Enzymelektroden (s. dort) 105-108
- implantierte Sensoren 108, 110
- katalytische 107
- Kohlenstoffpaste-Elektroden 92
- Nadelelektroden 110
- optoelektronische 107
- potentiometrische 107
Elektronentransfer
- direkter heterogener 160
- direkter, Redoxenzyme 108
Elektrophorese
- Agarosegel-Elektropherese (s. dort) 171, 173
- Gelelektrophorese 64
- Kapillarelektrophorese 112
ELISA 53-56
- Sandwich-ELISA 56, 195-201
Ellman-Reagens 151
Endpunktmethode 36-37
Enzym/enzymatisch 15-17
- Aktivierungsenergie 22
- Aktivitätsmessung 152
- allosterisches 30
- gekoppelte Enzyme 135
- häufig verwendete Enzyme 41-42
- Immobilisierung 87, 121-134
- Isoenzym (s. dort) 30
- Klassifikation (s. Enzymklassifikation) 16-17
- Malatenzym 137
- Markierungsenzym 185, 195
- Substratbestimmung, enzymatische, Nachweisreaktionen (s. dort) 27, 32-42
- pH-Optimum 22
- Redoxenzyme, extrinsische (s. dort) 108
- Spezifität 20-22
- Struktur (s. Enzymstruktur) 18
Enzymaktivität 27-29
- Messung 28
- molare Aktivität 28
- spezifische Aktivität 28
Enzymanalytik 15-42
Enzymassays 7
Enzymeinheiten 27-28
- Wechselzahl 28
Enzymelektrode 105-106
- Glucose 106
- nach Clark 106
Enzymhemmtest, in vitro (s. auch Hemmtest) 12-13
Enzymhemmung 152
- Mechanismus 152
Enzymimmunoassay (EIA) (s. auch Immunoassay) 49-57, 183-193
- kompetitiver 183-193
- für 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure 189
- Optimierung 191
Enzyminhibitorenhemmung (s. auch Hemmung) 29
Enzymkinetik 144-145
- Bestimmung 144
- Burk 144
- KM 144
- Lineweaver 144
- Mickaefo-Menten-Gleichung 144
- Vmax 144
Enzymklassifikation 16-17
- Hauptklassen 16-17
Enzymkonzentration 29
Enzymmarker 104
Enzymmembran, Gelatine 127
- Glucoseoxidase 127
Enzymreaktor 121, 125
- Glucoamylase 132
Enzymsensor 121
Enzymstruktur 18
- Primärstruktur 18
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